Hvad er Shotgun sekventering?

Shotgun sekventering er en fremgangsmåde til DNA-sekventering, hvorved en lang strækning af DNA er fysisk opdelt i små (ca. 2.000 basepar) fragmenter, som klones, sekventeres og samles ved hjælp af computer analyse. Den blev udviklet og gjort berømt af Craig Venter i Celera Corporation. Venter udviklet teknikken i 1996, mens de arbejder på Institut for Genome Research.

Venter grundlagde Celera i 1998 med den mission at sekventere det humane genom inden for tre år. Dette mål var i direkte konkurrence med den allerede er i drift Human Genome Project, et konsortium af universiteter, der arbejder sammen om at sekventere det humane genom bruger en ældre strategi kaldet kort-baserede eller BAC-til-BAC sekvensering. Denne fremgangsmåde involverede først at bryde genomet i 150.000 basepar stykker kaldet BAC'er, samling BAC'erne i rækkefølge, og derefter sekventering af hver BAC i detaljer.

Hele genomet shotgun-sekventering uden om oprettelse og kortlægning af AKB og starter lige på med DNA-sekventering. Processen starter med at erhverve en prøve af DNA med høj molekylvægt fra organismen af ​​interesse og fysisk bryde det op i små stykker ved at føre den gennem en snæver gauge sprøjte eller sonikering det, en måde at bryde prøven ved hjælp af lydbølger. Shearing er en tilfældig proces, så sekvenserne af fragmenterne vil have en vis overlapning mellem dem. Shearing ikke specifikt skabe 2.000 basepar fragmenter nødvendige til sekventering, snarere fragmenter af den ønskede størrelse skal renses fra blandingen.

Det næste skridt er at slutte sig til DNA-fragmenter med bærer-DNA kaldes en vektor. Denne proces er kendt som kloning, og det skaber et sekventering bibliotek, hvorfra sekvensen af ​​hele genomet skabt. Sekvensen for hver klon i biblioteket bestemmes, og computer-analyse anvendes til at finde overlappende eller kontinuerlige sekvenser i hvert fragment. Samling af overlapninger skaber en "contig", som er en lang kontinuerlig strækning af DNA-sekvens.

Shotgun kloning vil normalt resultere i nogle huller mellem contigs fordi nogle sekvenser mangler fra biblioteket ved en tilfældighed. Huller kan fyldes ved at lave et nyt bibliotek eller ved at bruge kendte sekvenser for at udvide udad fra contig'en. Fordi shotgun sekventering sekvenser DNA-fragmenter tilfældigt, er mange fragmenter sekventeret mere end én gang, skabe større sikkerhed for, at sekvensen er korrekt, end hvis hvert fragment kun er blevet sekventeret én eller to gange.

Det menneskelige genom blev sekventeret både af Human Genome Project ved hjælp af kort-baserede sekventering og ved Celera hjælp shotgun-sekventering. Shotgun sekventering er nu den foretrukne metode til andre former for genom sekventering. De fulde genomer af mange organismer, såsom planter Arabidopsis thaliana, ris, koen, hund, kylling, chimpanse, rotte, mus, pufferfish og mange mikroorganismer er blevet sekventeret på denne måde.

  • En lang DNA-sekvens er brudt i små stykker i shotgun-sekventering.
  • Shotgun sekventering er nu den foretrukne metode til mange slags genomsekventering.

© 2019 Zajacperrone.com | Contact us: webmaster# zajacperrone.com